アシベを求めて（３）

複合体が可溶化出来れば精製なんてオチャノコサイサイと思っていたのが大間違いで、結果として、単に我々の腕が悪かっただけなのでしょうが、MS2、PP7などのタグをつけて複合体を引っ張ってくるというアプローチはうまくいきませんでした。うまくいかないというのは要するに、関係のないRNAで引っ張ってきたコントロールとほとんど銀染のパターンが変わらない、ということです。

ーncRNAのモル数がタンパク質のモル数に比べて圧倒的に少ないために、バックグラウンドに隠れてしまう。
ーncRNAが非特異的にタンパク質に結合してしまうので、特異性が出ない。

という２つのことが大いに考えられるわけですが、実際の所どうなのでしょう？PBSで溶かしたらうまくいった！！という話が今後出てきてきてくれたら、むふふ、、、電車の中で思い出し笑いして人に見られて眠ったふりしてしまいます（ふ、古い）。

ともあれ、普通に溶かして精製してというアプローチに関しては勇気ある撤退をする事にして、でもそのまま撤退するのもあまりにも悔しいので、せっかくncRNA複合体を分画できたのだから、それをバンドでなく顕微鏡で見てやろうと思いました。そう。僕は顕微鏡マニアなのです。X線フィルムではなかなか見た気にならない。やはりレンズの向こうの像を見ないと、、、

ということで、SDGの分画をPLLコートしたスライドグラスにのせて、そのままin situ hybridization!　見えるかどうか半信半疑でしたが、GomafuとMalat1の複合体らしき着物が見えた時にはちょっぴり感動しました。I君、ナイスです。精製しているわけではないのでほかの複合体もたくさん基板上に乗っているでしょうからこのままAFMで観察、とかいうことは出来ないとは思いますが、生化学的な分画を顕微鏡で見る、というのは意外と簡単で、今後、生化学が得意な方々が試されればいろいろ面白い事が分かってくるかもしれません。というか、一分子観察とかは、基本的にはそういう発想なのかもしれませんが。

ともあれ、アシベ探しは振り出しに戻ってしまったわけですが、（１）でちょっと触れた通り、siRNAライブラリースクリーニングが、意外にも、うまくいっている感触がありました。発想は単純。ncRNAと複合体を作っているタンパク質がもしあるのであれば、それをノックダウンすれば、ncRNAの細胞内局在が変わったり、ncRNAの安定性が変化したりするのではないか、ということです。で、ncRNAと複合体を作っているのであれば、きっとそのタンパク質には既知のRNA結合ドメインを持っているだろうという事で、既知のRNA結合タンパク質のうち発現量の多いものから片っ端から購入したsiRNAのライブラリーをHさんが気合いでスクリーニングして、Celf3なるタンパク質が取れてきたわけです。Celf3をノックダウンすると、Gomafuが著しく減少する。これはCelf3がGomafuの安定化に関わっていることを示唆しています。しかも、Celf3は神経系の組織にしか発現していない。Gomafuも神経系でしか発現していない。実は、Gomafuを体全体で発現するトランスジェニックマウスを作っていたのですが、神経系の組織以外では発現が意外と少なく、これも神経系特異的に発現するCelf3がGomafuを安定化しているという仮説で説明できるかもしれない！！

　というわけで、Celf3を発現していないL-cellにGomafuを発現させ、さらにCelf3を発現させたらどうなるのか、というこれまた単純な発想で見てみたらツモ一発か！！L-cell ではGomafuはあまり核に蓄積しないのですが、Celf3を発現させると、それが奇麗に見られるようになる？？？実はこれは僕自身がやった実験で、にわかには信じがたかったのですが、結果は奇麗！！

と、これは自慢のデータだったのですが、ラボのメンバーには再現できないと却下されてしまいました。。うーん。難しい。トランスフェクションされやすい細胞がGomafuが蓄積しやすいとか、そのほかいろいろこの手のデータが出る可能性は考えられますね。Celf3を発現していてもGomafuが蓄積しない細胞はこの視野以外ではたくさんみられましたし、たぶん、Celf3だけあればよいというわけではないのだろう、ということで、これはお蔵入り。

でも、Celf3が本当にGomafuと相互作用しているのか？と聞かれると、心もとないところはあります。そもそもCelf3がGomafuの発現を制御しているだけかもしれません。やはりここは（直接）結合しているかどうかを確かめないと、ということでUV-cross link免疫沈降をすると、UVを当てた時だけ共沈してきます。しめしめ。ちなみに、当初ネガコンとしてとったMalat1やら7SKともCelf3は結合しているようです。

ともあれ、かなり直接に、GomafuとCelf3は結合している、ということが予想されました。しかし、Gomafuのin situ hybridizationとCelf3の二重染色をすると、

どう見ても重ならない。。。免疫沈降で共沈するけれども染色では共局在しない。これは経験上ncRNAと「結合」タンパク質との間では良くあるパターンで、レフリーの半分は、じゃあ結合事態がうそなんだろう、という反応を示し、レフリーの半分は、もう少し違う条件で染色をしたら？と言ってくれるのですが、どれだけ色々な条件を試しても、染色でCelf3がGomafuと共局在することはありませんでした。

というわけで、この、最初はグー！の実験は、さらに迷走に迷走を重ねる事になってしまいました。

中川