線虫 C. elegans と non-coding RNA 研究について（３）

さていよいよこのシリーズも最後。田原さんご自身の研究のご紹介です。「線虫を用いた生化学」とかさらっと読み流してしまいそうですが、最初にそれを立ち上げるのにはいかなる苦労があったのか、行間から読み取って下さい。線虫と言えば遺伝学ですから。吉良邸に討ち入るぐらいの覚悟がないと、こういう「奇妙な組み合わせ」はうまくいかないのですよね。多くの場合。

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　私が研究している RNAi (RNA interference) 現象も、線虫で発見されたものである。線虫の初期発生において非対称分裂が正常に生じない par 変異体の原因遺伝子をクローニングするために Kemphues のグループが行った実験が、RNAi 現象が認識されるきっかけとなったと言える。par 変異が位置する染色体領域に対応する複数の遺伝子クローンから RNA を in vitro 合成して個体にマイクロインジェクションし、RNA 導入による発現阻害が par 表現型をコピーする遺伝子を探す実験を彼等は行った。不思議なことに、アンチセンス RNA のみならず、センス RNA を注入しても標的遺伝子の発現阻害が起こることが報告された。同様の実験手法を mom 遺伝子群の解析に用いた Mello および Priess のグループらは、古典的なアンチセンス RNA の作用モデルと区別する意味を含めて、線虫に外来 RNA を注入した場合に生じる遺伝子発現の阻害を RNAi と呼ぶことにした。そして Fire と Mello らは、1 本鎖であるアンチセンス RNA やセンス RNA よりも 2 本鎖 RNA (dsRNA) を注入する方が RNAi を生じさせる上で効果的であることを発見した。線虫の研究をヒントにした結果、様々な真核生物において dsRNA が遺伝子発現の阻害に有効であることが示されてきている訳である。
　引き続いて RNAi の反応機構を遺伝学的に解析するために、RNAi 活性を欠損した線虫変異体 rde (RNAi deficient) のスクリーニングが行われ、動物において RNAi に関与する因子として初めて見つかった rde-1 遺伝子及びその他複数の遺伝子が同定されてきた。ちなみに、rde-1 遺伝子は Argoanute 蛋白の一つをコードしていた。しばらくして、植物の RNA サイレンシングにおける中間産物として small interfering RNA (siRNA) が発見され、加えてショウジョウバエや哺乳類細胞由来の細胞抽出液を用いて RNAi 反応を in vitro で再現して解析する無細胞反応系が開発されて研究が進展した結果、RNAi の反応機構においては siRNA が重要な役割を果たしていることが分かってきた。ハエ等を用いた生化学的解析によって示されたのは 2 つの鍵となる反応である。まず最初に、導入された dsRNA は Dicer の RNase III 活性によって 5' 末端にモノ燐酸を持ち 3' 末端が突出している 2 本鎖 siRNA (初期型) へと断片化される。引き続いて、siRNA はエンドヌクレアーゼ活性を持つ Argonaute 蛋白と一緒に RNA-induced silencing complex (RISC) と呼ばれる複合体を形成し、RISC は標的 mRNA を配列特異的に認識して切断する (Slicer 活性)。
　筆者は RNAi の研究を線虫の RNAi 欠損変異体の単離という遺伝学的なアプローチから始めたが、遺伝学だけでは RNAi の機構における反応の流れが理解しづらいという印象を抱いた。そこで、RNAi 反応における酵素活性を生化学的に解析するための無細胞反応系を線虫においても独自に開発し、生化学と遺伝学を組み合わせた総合的な解析を行うアプローチを取ることにした。加えて、RNAi における第三の鍵と言えるサイレンシングシグナルの増幅を担う RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ (RdRP) の活性を生化学的に解析したいと考えた。線虫の RNAi においては、トリガーである長い 2 本鎖 RNA から 5' 末端にモノ燐酸を持つ初期型 siRNA が Dicer によって産生され、さらに標的 mRNA を鋳型として 5' 末端にトリ燐酸を持つ二次型 siRNA が RNA 依存性 RNA ポリメラーゼによって産生される。線虫の細胞抽出液を用いて構築した無細胞反応系を利用した研究により、RdRP 複合体は Dicer 非依存的に二次型に対応するトリ燐酸化 siRNA を合成する活性を持つこと、加えて二次型のトリ燐酸化 siRNA が初期型のモノ燐酸化 siRNA よりも遥かに強力に標的 mRNA を切断する Slicer 活性を誘導すること、トリ燐酸化 siRNA によって誘導される Slicer 活性を担う因子は Argonaute 蛋白の一つである CSR-1 であることを筆者らは示した。C. elegans においては生化学的な研究があまりなされていないことから生化学的な研究には向いていないと考える研究者もいるが、系が出来上がった後での話ではあるが線虫の細胞抽出液で構築した RNAi の無細胞解析系は上手く動く。C. elegans は生化学的な解析に不向きな生物では全くないと筆者は思うが、付随する実験で時として必要とされるリコンビナント蛋白の作製は他生物の蛋白よりも明らかに難しいことも事実である。おそらく、室温よりも高い温度（つまり構造が壊れ易い状態）においても正確にフォールディングできるようになっている幾つかの他生物の蛋白に比べると、比較的低温で増殖する C. elegans の蛋白は一般にフォールディング能力が弱いのもしれない。ともあれ結果的に、外来性の dsRNA によって誘導される RNAi の線虫における反応機構の概略を記述できたのではないかと考えている。しかしながら、線虫と他生物における RNAi 反応機構は類似した蛋白因子を用いているが、RNA の流れについてはかなりの違いが見受けられることも、自身および他グループの研究によって分かってきた。他生物と保存性の非常に高い機構が浮かび上がってくることを期待していたことから、少し残念に思っている。
　現在ところ筆者は、生化学的な研究から個体レベルの研究へ立ち戻って、生殖細胞に多い内在性小分子 RNA との相互作用を絡めつつ、他生物でも現象面で共通性の高い内在性の遺伝子発現調節機構の解明に挑戦しているところである。

線虫 C. elegans と non-coding RNA 研究について（２）

線虫エッセイ第二弾です。
線虫とRNAiというとMello&Fireの仕事が有名ですが、また、ずっと前に植物で分かっていたとかいう話も有名ですが、ヘテロクロニーがらみの話は発生屋の間では有名なものの、生化学的な話が中心となりがちなRNAの研究分野では意外と忘れられがち、、、なことはないでしょうか。以下、田原さんです。

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II. 線虫における non-coding RNA 研究について
　ところで、non-coding RNA やそれらの制御に関与する重要な蛋白ファミリーには、線虫を用いた遺伝学的研究によって最初に見つかったものが幾つか存在する。
　小分子 RNA の一種である micro RNA は、線虫のヘテロクロニックな発生異常変異体の解析から見つかったものである。多細胞生物の発生現象では、発生ステージに沿って個々のステージ特異的な性質を伴って組織および器官が発達してゆく。同じグループに属する近縁の生物は非常に類似した発生パターンを示すことが一般的であるのに対し、同じグループに属するにも関わらず例外的な生物種では幾つかの器官の発生タイミングが促進または遅滞していることがあり、その現象はヘテロクロニー（hetrochrony : 異時性）と呼ばれる。例えば、両生類のアメリカサンショウウオは幼生期にはエラを持ち、変態に伴ってエラを失って成体では肺を持つことが一般的である。しかしながら、ある種のアメリカサンショウウオはエラを持ったまま成体になるというヘテロクロニーを示し、変態を進める遺伝子制御が正常に働いていないことが推測される。
　C. elegans は孵化後に、1 齢幼虫 (L1) から脱皮を繰り返して 2, 3, 4 齢幼虫 (L2, L3, L4) そして成虫へと発生していく。上皮細胞に着目すると、ステージ毎に特有な細胞増殖パターンを示しつつ発生が進み、各ステージに特異的なコラーゲン遺伝子等の発現も確認される。つまり、上皮細胞の性質は L1 から L4 そして成虫期の各ステージで厳密に区別されていると考えられる。線虫においては、上皮細胞におけるステージ特異的性質の出現順序が乱れている（つまりヘテロクロニックな）変異体が同定されてきており、原因遺伝子のクローニングもなされてきた。lin-14 は新規の核蛋白そして lin-28 は Y ボックスを持つ蛋白をコードしており、それらの正の活性は上皮細胞の L1 ステージ特異的な運命決定に必要である。興味深いことに、lin-14 と lin-28 の蛋白は L1 期だけに発現しているが mRNA は L1 期以降も転写されている。このような mRNA の転写と蛋白発現の差を制御する遺伝学的因子として、Ambros のグループ及び Ruvkun のグループは lin-4 変異体の原因遺伝子をクローニングした。その結果、lin-4 遺伝子はステージ特異的に発現する 21 塩基長のアンチセンス RNA をコードしていることが判明した。アンチセンス RNA である lin-4 は L2 期以降に発現し、lin-14 と lin-28 の mRNA の 3' 非翻訳領域に結合し不必要な時期の mRNA を不安定化するものと考えられる。発生におけるタイミングの制御に関わっているという意味で、lin-4の産物は small temporal RNA (stRNA) と名付けられた。lin-4 の成熟型 stRNA の大部分の塩基は標的 mRNA に対して相補的であるが、中央部に塩基対のミスマッチが確認される。又、lin-4 の 21 塩基長の成熟型 stRNA はヘアピン前駆体から切り出されて生じてくる。その後、様々な生物種において小分子 RNA の解析がなされた結果、ヘアピン状の RNA 前駆体から産生される小分子アンチセンス RNA が数多く同定され、lin-4 を含めて micro RNA と呼ばれるようになって盛んに研究されているのは御存知の通りである。

線虫 C. elegans と non-coding RNA 研究について（１）

これから３回にわたり、研究歴がそのまま線虫のRNAi研究の歴史という田原さんから渾身の研究紹介をしていただきます。歴史を知る人の言葉の重みを味わって下さい。

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田原浩昭　（筑波大学大学院・人間総合科学研究科）

　この場を借りて、筆者がモデル生物として用いている線虫 C. elegans と関連する non-coding RNA の研究について記してみたい。

I. モデル生物としての線虫について
　Caenorhabditis elegans は土壌線虫であり、小さな無脊椎動物である。1960年代の中旬ぐらいから Brenner らによって、行動や発生を遺伝学的に解析するためのモデル生物として用いられ始めた。私の出生年を考えると、C. elegans を用いた生物学的研究の歴史は、私の年齢とおおまかに同じぐらいということになる。
　線虫は眼も手足も持っていない生物であるが、上皮組織、神経系、筋肉、消化管、生殖細胞という多細胞動物として基本的な組織を持ち合わせている。成虫の体長は約1mmであり、卵の大きさは約50μmである。C. elegans の成虫における細胞数は生殖細胞を除くと約 1,000個存在し、多細胞生物としては細胞数が少ないという特徴を持っており、どの個体を見てもほぼ同じ細胞系譜を示しつつ発生が進行する。体の透明度が高く微分干渉顕微鏡によって生きたまま核の位置を観察できるという利点を生かして、Sulston らによって C. elegans の発生における全細胞系譜が記述されている。又、神経系については、White らによる連続切片の電子顕微鏡写真解析によって 302個の全ニューロンの形態やニューロン間の化学シナプスおよびギャップ結合が詳しく調べられており、線虫を用いた神経研究の基盤情報となっている。
　線虫の一般的な培養はアガープレート上で大腸菌を餌として常温で行われる。線虫のライフサイクルは多細胞動物としては短く、受精から孵化まで約半日間の胚発生を行い、孵化してから成虫になるまで更に約 3日間要する。線虫の利点の一つは幼虫を凍結保存できるという点であり、手持ちの多様な変異体の中で現在使用していない系統を培養し続ける必要は無い。又、餌が豊富な状態における寿命は 2週間弱であるが、飢餓状態になると耐性幼虫と呼ばれる代謝の落ちた特殊な発生ステージへ移行して数ヶ月は餌の無い状態で生存できることから、凍結せずに短期保管することも容易である。遺伝学的な研究用途の多細胞モデル動物の中では、C. elegans は培養における人的な負担が若干少ない生物であると言えるかもしれない。
　C. elegans を用いた研究の売りの一つは遺伝学的な解析ができることである。他種の線虫を含む多細胞動物の多くは一般的に雌とオスの交雑によって増殖するが、例外的に C. elegans の主要な性形式は雌雄同体であり自家受精で増殖する。自家受精で増殖するという特徴は非致死性の劣性変異の遺伝学的な単離を容易にしており、加えて低頻度で出現するオスを掛け合わせに用いることによって目的とする変異の遺伝学的なマッピングを行うことができる。C. elegans は体の大きさが比較的小さいことから、目的とする表現型を効率的に検出する系の開発しだいで、大規模な（つまり非常に多数の個体を使用した）遺伝学的スクリーニングが可能である。又、逆方向遺伝学による解析も盛んに行われている。一般的なアプローチは、紫外線や化学変異薬剤で処理した線虫集団を小分けしたライブラリーを作製し、そのライブラリーから目的の遺伝子に欠失が入った変異体を PCR によるシブセレクションで単離するという方法である。別の方法として、目的遺伝子の近傍にトランスポゾンの挿入を持つ系統が存在する場合に、トランスポゾンの切り出しによる二重鎖切断を利用した相同組み換え反応によって目的遺伝子を改変する技術も最近になって開発されているが、応用例は未だ少ない。
　ゲノムに目を向けると、C. elegans の 5対の常染色体 (I~V) そして 1対の性染色体 (X) を持っている。性別は X 染色体の本数によって規定されており、雌雄同体では XX であり、X 染色体が偶発的に脱落して X0 となった場合はオスになる。C. elegans はゲノムリソースが良く整備されており、多細胞生物の中で最初にゲノム配列が決定された生物である。染色体に沿ってコスミドや YAC のコンティグを並べていく整列クローンライブラリーが作製され、それらのクローンを材料として（次世代シークエンス技術以前の）蛍光シークエンサーを用いて配列解析が Waterston と Sulston らによる国際共同研究によってなされた。左記のゲノムプロジェクトと並走する形で、C. elegans の cDNA クローンを系統的に収集して分類する cDNA プロジェクトが行われており、ゲノムプロジェクトでは完全に予測できない mRNA 配列の厳密な決定、そして RNAi による遺伝子発現抑制や蛋白発現実験等へ活用されている。幾つかの cDNA プロジェクトが行われてきているが、最もメジャーなものは遺伝学研究所の小原グループのリソースである。
　又、目的とする遺伝子産物を詳しく調べる際に有用な技術の一つは遺伝子導入であり、幾つかの手法で形質転換線虫を作製することができる。話が長くなるので詳細は述べないことにするが、線虫のゲノムへ安定的に遺伝子導入する方法については迅速で簡便な方法は未だ存在せず、新しい手法の開発が求め続けられているように思う。知人と、自分達の手でなんとか良い方法を開発できないかと話し合っているところである。