ドラゴン怒りの鉄拳

こんにちは、泊研D3の深谷です。先月、岩川さんとともに、ウィスラーで行われたKeystone symposiaに参加してきました。現地でスキーに行った楽しい思い出など書こうと思っていましたが、研究について思うところがあったので書いてみます。

miRNAがどのように働いているのかは未だに明確にはなっていませんが、少なくとも「Poly(A)鎖の分解とmRNAの不安定化」とそれとは独立した「翻訳抑制」を介して機能しているというのが、この業界のコンセンサスのように思います。多くの人がより詳細な仕組みを明らかにしたいと、現在も精力的に研究を行っています。

先日、イギリスの研究グループの論文がサイエンス誌に掲載されていました(http://www.sciencemag.org/content/340/6128/82.abstract)。この論文で提唱されているmiRNA作用モデルは興味深いものです。それが本当であるならこの分野における理解が大きく前進したと言えると思います。しかし、僕は、逆に、この論文が混乱を招いてしまうことを危惧しています。一番の問題点は先行研究を無視して、あたかも彼らが新しい発見をしたかの様に記述している点にあります。

彼らはmiRNAの作用点を明らかにするために、種々のIRESを5´UTRに持つレポーターmRNAを用意し、miRNAに対する感受性を調べる実験を行っています。そして、この実験結果は、彼らが提唱するモデルの重要な根拠のひとつとなっています。

しかし、同様の実験はこれまで何度も行われており^1-9、ときには相反する実験結果を生み出してきました。翻訳という現象は考慮すべきパラメーターが多く、特殊なレポーターmRNAを用いた解析のみで軽々に結論を出すべきでは無いことは、今では多くの研究者の認識するところです。ですが、この論文の著者らはこういった状況を顧みずに、彼らの結論に矛盾するような過去の実験報告に対しても、「A number of factors may explain previous contradictory results involving miRNA-targeted IRES reporters (Jackson et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010)」と、レビュー記事を引用するだけで、真摯に議論することを避けています。

同様に、「翻訳抑制」と「Poly(A)鎖の分解」の関係に関しても、あたかも自らの結果が画期的であるかのように主張していますが、その一方で、その結論に反する過去の報告^6,10-13を無視しています。その他にもいくつか問題点があるように感じます。

トップジャーナルとなればなおさら、影響力が大きい訳ですから、公平な視点で語ってほしいな、と思いながらも、これらの不満はサイエンスに出たことへのひがみかもしれません。。

今日は、こんなことを考えながら実験していたら、集中できずにいろいろと操作ミスをしました。

1. Pillai et al. Science (2005)

2. Petersen et al. Molecular Cell (2005)

3. Humphreys et al. PNAS (2006)

4. Kiriakidou et al. Cell (2007)

5. Mathonnet et al. Science (2007)

6. Wakiyama et al. Genes and Development (2007)

7. Lytle et al. PNAS (2007)

8. Walters et al. RNA (2010)
9. Ricci et al. Nucleic Acid Research (2011)

10. Iwasaki et al. Molecular Cell (2009)

11. Fabian et al. Molecular Cell (2009)

12. Eulalio et al. RNA (2010)

13. Fukaya et al. Embo Journal (2011) 

追記


さらにこの論文で、二種類の異なる5'UTRを用いて、その熱力学安定性によって翻訳抑制の程度が変化するというデータを示しています。 しかしすでに過去に、5'UTRの配列によって抑制の程度が変化すること、さらに、その熱力学的安定性と必ずしも相関がないことが示されています(六種類の内在遺伝子の5´UTRを用いて、14参照）。サイエンスの論文の著者らはこの論文を引用すらしていません。

14. Ricci et al. Nucleic Acid Research (2013)

Y本氏からのメール #3

岩川さんのものすごく面白い話題のあとに、ゆるい記事ですみません。。

H川担当のこちらの記事は、
あくまでも「ちょっとやってみたい人」向けなので（解析というか作業レベル）
軽〜く読んでいただければ幸いです。
作業のあとの解析が真に頭を使うところのようで
はまったひと（Y本さん）は実に楽しそうです。
まあでも、解析まで行き着くにはまず作業が必要ということで、、、

SRAファイルをFASTQファイルに変換する

何とかBEDファイルが見られるようになったものの、
見てみたいデータがBED形式で登録されていないという状況に直面しました。
(#2投稿参照)

BEDファイルはいずこ

困りました、とY本さんにメールを送った次の日に返ってきたのが以下のメールです。

**********************************************************************************
差出人: Y
日時: 2012年8月12日 10:09:45JST

Y田研でCPUが余っていたのでちょっと変換してみました。
もし良かったらどうぞ。
sandy-bridgeのcore-i5(4core)で30minといったところです。

madogiwa-no-iMac:SRR398208 xxxxxxxxxxxx$ fastq-dump -A SRR398208
↓
madogiwa-no-iMac:SRR398208 xxxxxxxxxxxx$ bowtie -p 4 -v 2 --sam --chunkmbs 1024 
--best hg19 /Users/xxxxxxxxxxxx/SRR398208/SRR398208.fastq /Users/xxxxxxxxxx/
SRR398208/SRR398208.sam
**********************************************************************************

SRAファイル (GEOに登録されているデータ)をFASTQファイルに変換して、
Bowtieでマッピングしてくれたようです。
おおー。たった一日の間になにがあったのでしょうか。

ちなみに私は
「$」この文字が何なのかもさっぱり分かりませんでした。ドル？

ありがたくファイル頂戴します！と受け取ったのですが、
自分でもやってみたいな、と思ったのでMacのターミナルを触ってみることにしました。

アプリケーション＞ユーティリティ＞黒い画面です

ターミナルを使い出すにあたって
まずXcode（コンパイラとか色々入っているもの）をダウンロードしました。
ダウンロードの仕方はこちらが詳しいです。

次に、SRA tool kit をダウンロードします。
ホームディレクトリにこういうツールをまとめておくフォルダを作って
そこに置いておくと便利だそうなので、そうしてみました。

こんな感じのフォルダを作ってSRA tool kitを入れてみました

SRA tool kitの中にはこんなものが入っています。

binのなかにプログラムが入っています。
面倒なので説明は省きますが、”PATHを通す”という作業をすると使いやすくなります。
通さなくても使えます。使い方は以下です。


1．プログラムのあるディレクトリ(SRA tool kitフォルダ)に移動する

ターミナルにcdと打って、スペースを入れて
移動先のフォルダをターミナルにドラッグ＆ドロップするのが簡単かと思います。

2．変換したいSRAファイルをSRA tool kitのフォルダに入れる

3．fastq-dump (SRAファイルをFASTQに変換する)を実行

ターミナルに ./bin/fastq-dumpと打ってスペース入力後、
SRAファイルをドラッグ＆ドロップします。

「.」は、今いるディレクトリ(=SRA tool kitフォルダ内)を示します。
したがって、「./bin/fastq-dump」というのは
「SRA tool kitフォルダ内のbinフォルダ内のfastq-dumpを実行」ということになります。
PATHを通しておくと、1と2の作業が要らなくなるんではないかと思います。

SRR107032.sraというのがSRAファイルです

4．実行するとfastqファイルが出来ます。

できました

おそまつさまでした。


長谷川（理研・中川研）

Keystone symposiumに参加して

今年のKeystoneはバンクーバーオリンピック会場の一つでもあったWhistlerで開催されました。美しい雪山に囲まれた会場の近くにはバーやレストランが立ち並び、歩いて数分でゲレンデという、学会会場として最高の立地であったと思います。

私は今年で３年連続Keystoneに参加しましたが、今回もハイレベルなトークと活発なポスターセッションに大いに刺激を受けました。しかし今回なにより印象に残ったことは発表の内容ではなく、あるQ and Aでの一幕でした。発表者は有名ながん研究者であるP、その発表に対してコメントしたのはsmall RNA界の大物Zです。

背景を少し話しましょう、Pは2010年にがんに関わる内因性miRNAスポンジを発見しトップジャーナルに発表しました。彼はmiRNA response element (MRE) を持つすべてのmRNAはMREを介して「会話」をしている（相互作用している）というセオリーを提案し、それらのRNAを「Competing endogenous RNA (ceRNA)」と名付けました。

今回Pは最近発表されたcircular RNAもceRNAであり、自分が考えたセオリーの広がりを情熱的に語ったわけです。またシンプルな系を用いてmiRNA ターゲット同士が競合し、互いの遺伝子発現に影響し合うという結論をだし、ceRNAセオリーの証明を試みていました。初めて彼のtalkを聴いた他領域に属する人は単純にすごい！新しいセオリーだ！と興奮するのでしょうが、皆様御存知の通りこのセオリー、そしてそれらの研究は別に新しいものではありません。

Q and Aに移り、Zはマイクを持ち、ゆっくり落ち着いた声でコメントしました。「私はこれほど過去の研究を無視した発表を聴いたことがない…」。

１、２分間miRNAターゲットとmiRNAデコイに関するこれまでの研究の歴史を滔々と語り、Pがやっていることは別に新しくはないということをわかりやすく皆に、そしてPに伝えたわけです。怒りを込めて。

先程まで情熱的であったPは小さい声で「そのとおりだ」と一言。

Zさんの一刀両断コメントには賛否があるかもしれませんが、私は感動しました。

新しい言葉を作り、過去の研究をないがしろにし、まるで全く新しいアイデアを提唱したかのように振る舞うというのは良くない。やはり先行研究には最大限敬意を払うべきだと思います。それは実験材料や実験系でも同じですね。

トップ研究者のこんな激アツなやり取りを見られるのもKeystoneならでは。来年も是非参加できたらなとおもいます。

岩川　（泊研）

神Neilさんの神レビュー

神Neilさんが渾身の素晴らしいレビューを書かれています。とりあえずアブストラクトをコピペしますが、以前このブログでもディスカッションされていた、こんな疑問とか、こんな疑問とか、つまるところ、長鎖ノンコーディングＲＮＡの研究ってこれで良いの？という研究現場サイドの戸惑いや疑問をぐぐっと濃縮して、非常に分かりやすく、as such満載で、書かれています。

本気でこの業界で仕事をしようとしている人は必見！！です。こういう素晴らしいレビューをきっかけにサイエンスは発展するのだと思います。Xistってややこしい、と思っていた人も、一気に多くの疑問が氷解することでしょう。

Noncoding RNA and Polycomb recruitment

Neil Brockdorff

RNA 2013; 19: 429-442

http://rnajournal.cshlp.org/content/19/4/429.abstract.html

A plethora of noncoding (nc) RNAs have been revealed through the application of high-throughput analysis of the transcriptome, and this has led to an intensive search for possible biological functions attributable to these transcripts. A major category of functional ncRNAs that has emerged concerns those that are implicated in coordinate gene silencing, either in cis or in trans. Xist and other ncRNAs have been shown to bind to PRC2, a repressive chromatin modifying complex. Silencing has been proposed to involve direct interaction between PRC2 proteins and the different ncRNAs. This review discusses the evidence for and against this hypothesis, in the process highlighting alternative models and discussing experiments that in the future will help to resolve existing discrepancies.

中川

評価と評価

大河ドラマついに始まりましたが、大河ドラマだけあって、毎日更新とはいかないようです。月にいっぺんぐらいでしょうか。暖かく、見守ってください。現在進行形でのバイオインフォマティシャン誕生物語になるか！とも思ったのですが。そもそも、まだ「成っていない」人が、現状を語るというのは、結構ハードルが高いのでしょう。

とは言え、先人の偉大な回顧録を聞く機会は多いですが、人生の糧にはなっても、実践的にはあまり役に立たない事が多い、なんてことはないでしょうか。いや昔は苦労しましてね、こんな材料を、こんなところで手に入れましてね、というのは、話としては面白いのですが、また、明日へのモチベーションは高くなるのですが、直接役立つという話ではありません。僕の世代の苦労話と言えば縮重プライマーを用いたファミリー分子取りやサブトラクションスクリーニングにまつわる話でしょうが、ゲノムが解読されて次世代シークエンサーがある今の若い世代の人には、１００％、役に立たんでしょう。仕事の価値というのは、時代によって変わるものです。昔の事をずっとやっていてもダメ。それは当然ですが、変化の早いこの時代、仕事の評価というのは、とてつもなく難しものだと思います。

論文の価値も、評価不可能です。インパクトファクター、引用数、いろいろありますが、ある一面を切り取っていますが、万能な評価ではないのは明らかです。インパクトファクターは論外ですが、引用数だけ見ても、それが学問的な価値を反映しているとは僕には到底思えません。少なくとも、僕自身がほんのちょっぴりサイエンスの世界で積み重ねてきた数少ない業績を振り返ってみても、自己評価（多分ピアレビューと言う意味ではかなり正確なはず）と、インパクトファクターは一致しないのはもちろんの事、引用数ですらあまり相関はありません。

話はそれますが、昨日、実に嬉しい出来事がありました。そう。第２回電王戦第一局。見事、コンピューターに、阿部光瑠４段が完勝しました。印象的だったのは、プロの解説者が口を揃えてこれは無理攻めだろうというコンピューター側の攻撃を、多くのコンピュータソフトの評価関数では「良し」としていた点です。プログラムの穴と言えば穴なのでしょうが、要は２０手ぐらいはずっと形勢が良いけれどもそのあとぱたりと形勢が悪くなる、という一手を、コンピューターは先を読めずに選んでしまっているのですね（それ以上先を読もうとすると組み合わせの数が指数的に増大するので宇宙の年齢ぐらい時間がかかってしまう）。将棋の場合は王さまが取られたら負けなので研究とは全く比較できませんが、コンピューターのプログラム上の評価関数の根本をくつがえすような阿部光瑠４段の差し回しは、同じ人類として快哉を叫びたいとともに、評価って言うのは一体なんなんだろう、ということを改めて思い返してしまいました。

野依さんは蓮舫さんに「歴史の法廷に立つ覚悟があるのか！！！！」と一喝されました。多くの研究者も同感だったに違いありません。僕もそうでした。が、正直、（科学技術を取り巻く諸問題に対する）日々の行動に関して歴史の法廷に立つ覚悟は、僕自身、あまりありません。人間、いろいろ弱いものですから。ただ、実験の結果だけは、これは真実ですから、信じられるし、覚悟もあるんですよね。残酷な事に多くの実験結果は「ふふふ、まだまだおぬし、未熟じゃのう」と今日もまた不適な笑いを浮かべているのですが。

中川

Y本氏からのメール #2

UCSC Genome BrowserでBEDファイルを見る(続)

さて、UCSCカスタムトラックにBEDファイルをアップロードする方法の後編を書きます。
前回触れた通り、ファイルのリンクを作成して、それを指定する方法です。

本家の説明ページはこちら。

ファイルのリンクをどうするかですが、
何通りか試したうちのうまくいったもの２つを以下に載せます。

1.    GEO Datasetsにあるファイルへのリンクを指定する

ファイルのリンクを右クリックして、「リンクのURLをコピー」を選択します。

 コピーしたURLを”Add Custom Tracks”の
"Past URLs or Data"下のbox内に貼付けてsubmitすれば完了です。

この場合、ペーストしたリンク先は
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geosuppl/?acc=GSM850170&file=GSM850170%5FHela%5FhnRNPU%5FCLIP%5Frep1%2Ebed%2Egz
と表示されますが、これは
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geosuppl/?acc=GSM850170&file=GSM850170_Hela_hnRNPU_CLIP_rep1.bed.gz
と同じことです。

2. Dropboxのパブリックフォルダを利用する

真ん中のやつです。

ちなみに現在、新規のDropboxアカウントでは
publicフォルダはデフォルトで作成されないそうなのですが。。

Publicフォルダ内にBEDファイルを放り込んで
右クリックで「パブリックリンクのコピー」を選択します。

リンクをペーストしてsubmitします。

できました。 

また、Galaxyにファイルをアップロードすると、そのままUCSCに表示することができます。

Galaxyへのファイルの転送ですが、

大きいファイル(2GB以上)の場合はFTP経由が推奨されています。
 

 

非常に便利なサイトなので、興味のある方は一度のぞいてみると良いと思います。

ただ、この方法はファイルのサイズが大きい場合は

うまく表示される時とされない時があって不安定な気がしています。

このようにBEDファイルをアップロードするために、一通りやり散らかしたあと、

衝撃的なものを目にしました。

Huelga et al.　Cell Rep. 2012 Feb 23;1(2):167-78.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22574288 
のデータです。(これまた著者の方に感謝して引用させていただきます) 

BEDファイルがない。BOWTIEって？
 

Googleいわく、bowtieとはシーケンサーのデータをmappingするソフトで

xxx.bowtieはその結果が入っているファイルらしいですが
その手のものにはBAMだのSAMだの、

他にも色々な形式があるらしいことが分かってきました。
どうやらSAMからBAMに変換して、BAMからBEDに変換する手順があるらしい。
とりあえずBEDファイルが欲しいんですが、

Y本さん、なんとか見られるようになるんでしょうか、これ？

**********************************************************************************
差出人: Y
日時: 2012年8月10日 08:53:02JST

おはようございます。

前に話していた、CLIPのデータ、

どうやらファイルの情報が足りないせいか、

SAMファイルに変換してもだめみたいです。
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**********************************************************************************
差出人: H
日時: 2012年8月11日 13:29:30JST
 

そうでしたかー。

いっそSRAファイルのほうをFASTQ変換して
自力でbowtieに投げてやろうかと思ってたのですが。。
情報ありがとうございます。
**********************************************************************************
 
悩める素人2名。しかし、このメールでY本さんはピンと来たらしいです。

#3に続きます。


中川研　長谷川

Y本氏からのメール #1

N川研H川とY田研Y本氏との間で半年に渡り不定期にやり取りされたメールと
本人たちの試行錯誤を公開するという(かなり恥さらしな)企画です。

エレキギターを手にしたバイオリニストの卵の苦悩はY本さんにおおいに語ってもらうとして
こちらでは超初心者による未経験者向けのエレキの弾き方、
もとい次世代シーケンサーのデータの触り方について綴りたいと思います。
自己流ですので、詳しい方が居りましたら適宜ダメ出しを強くお願い致します。

初回は「UCSC Genome BrowserでBEDファイルを見る」について書きます。
なお、すでにpublishされた論文のsupplement dataとして公開されているデータを覗いてみたい、
というような状況を想定しているので、大事な未公開データに適用するのは微妙かもしれません。

ある日、NCBIのGEO datasetsにH川が研究対象にしているRNA結合タンパク質の
CLIPデータが登録されているのをY本さんが見つけてくれたことから話が始まります。

話題に挙がっていたのは以下の論文のデータです。
著者の方に深く感謝しつつ引用させていただきます。

Xiao et al.　Mol Cell. 2012 Mar 9;45(5):656-68.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22325991

下画像がGEO Datasetsの実際のページです。

Downloadの欄にBEDファイルとSRAファイルがあります。
それぞれのファイル形式の説明は外部ブログ等の説明を引用させていただきます。

■ BEDファイルとは
http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html#format1
http://blog.amelieff.jp/?day=20121129
■ SRAファイルとは
http://g86.dbcls.jp/~yag/wordpress/archives/959

BEDファイルをUCSCゲノムブラウザのカスタムトラックにアップロードすれば
中身を見ることが出来ると聞いていたので、さっそく覗いて見てみようと思い、
こちらの手順を参照してアップロードすることにしました。
(「1.トラックの追加方法」を参照 (本件で使用したのは1.3.1))

しかし、情報共有フォーラムが提供してくれているファイルはアップロードできるのに、
自分でNCBI GEOからとってきたファイルはアップロードできないトラブルに陥りました。

うまくアップロードできた練習用ファイル。黒いバーがアップロードしたデータです。

うまくアップロードできなかった結果として表示された白い画面。
拒絶感が伝わってきます。

ファイルのダウンロードが上手くいかなかったのかと思い、
Y本さんが既にブラウザで中身を見ることができていたファイルを送ってもらいました。

**********************************************************************************
差出人: Y   
日時: 2012年8月1日 14:11:59

https://briefcase.riken.jp/XXXXXXXXXXX です。
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**********************************************************************************
差出人: H
日時: 2012年8月1日 17:40:34JST

どうもありがとうございます、試してみます。
にっちもさっちもいかなかったら、また泣きつきます。
**********************************************************************************

数日後。
 
**********************************************************************************
差出人: H
日時: 2012年8月3日 12:05:38JST

無事に私物Macからでもアップロードできるようになりました。
何が悪かったんでしょう。。
**********************************************************************************

ちゃんとアップロードできました

自分でダウンロードしたファイルと送ってもらったファイルに違いはありませんでした。
うまくいかなかった本当の原因はおそらく2つありました。

#1 Assemblyの指定が間違っていた
GEO Datasetsのページに「リファレンスゲノムはhg18ですよ」と
書いてあるのにも関わらず、hg19を指定していました。

#2 ファイルサイズが大きかった
アップロードできたファイルのサイズが92.3MBに対して
できなかったファイルは573.3MBとサイズに違いがありました。
Y本さんから「圧縮すれば良いじゃないですか」とアドバイスを受けたので試してみました。

ファイル圧縮方法 #1 Zip形式 (Mac右クリック)
結果： アップロードできず（Error Can't read fileと表示）

ファイル圧縮方法 #2 gzip形式 (Macターミナルからgzipコマンド使用)
結果： アップロードできた

gzipで圧縮するとうまくいきました。
今になって振り返ると、UCSC本家の説明書きにちゃんと書いてあります。

The custom track data may be compressed by any of the following programs: gzip (.gz), compress (.Z), or bzip2 (.bz2). 
Files containing compressed data must include the appropriate suffix in their names.

さて、UCSCカスタムトラックにアップロードする方法は上記の他に
ファイルのリンク(URL)を作成しておいて(つまりweb上にファイルを置いておいて)
それを指定するやり方もあります。

こちらの方が簡単なのですが、ここらへんで#2に続きたいと思います。


中川研　長谷川